تولید متالوپروتئیناز 63 کیلو دالتونی (gp63) لیشمانیا ماژور در مخمر متیلوتروف Pichia pastoris

Authors

شعبانی, علی اکبر

شهباززاده, دلاور

مهبودی, فریدون

مک مستر, روبرت

کاظمی, بهرام

کریمی, محسن

Abstract:

سابقه و هدف: با توجه به مشکلات ناشی از لیشمانیا به عنوان یک انگل داخل سلولی بیماریزا که بیش از 12 میلیون نفر را در بیش از 86 کشور جهان مبتلا نموده است و در راستای ارزیابی توانایی گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی (gp63) لیشمانیا ماژور به عنوان یک ایمنوژن در تحریک سیستم ایمنی میزبان و همچنین آنتی ژن تشخیصی، ژن کد کننده مولکول فوق در وکتور دو میزبانه pHIL-S1 به منظور بیان آن ژن در مخمر متیلوتروف P.pastoris کلون و بیان گردید و در نهایت خصوصیات مولکول نوترکیب حاصل نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. مواد و روش ها: ژن تغییر یافته gp63 به گونه ای که فقط پروتئین بالغ راکد نماید، در وکتور دو میزبانه (و همچنین پلاسمید puc19) کلون گردید. مخمر Pichia pastoris (سویه های KM71 و GS115) با پلاسمید دو میزبانه نوترکیب و همچنین با پلاسمید pHIL-s1 (به تنهایی) ترانسفورم گردید. کلون های ترانسفورم شده در محیط فاقد هیستیدین انتخاب شدند، DNA کروموزومی ترانسفورمنت ها تخلیص گردید و با روش های PCR و S.B) Southern Blotting)، وارد شدن ژن فوق در کروموزوم مخمر نوترکیب مورد ارزیابی قرار گرفت. ترانسفورمنت های تایید شده، در محیط حاوی گلیسرول BMGY، تا حصول کدورت OD600=6 کشت و سپس جهت بیان ژن هترولوگ فوق به محیط حاوی متانول، BMMY، انتقال داده شدند. با افزودن متانول به صورت روزانه، حالت القا در آنان حفظ گردید. با تخلیص RAN و انجام N.B) Northern Blotting) صحت نسخه برداری و همچنین بیان ژن فوق (تولید پروتئین نوترکیب) با ژل 12% SDS-PAGE، وسترن بلاتینگ و IFA مورد ارزیابی قرار گرفت. میکروسکوپ الکترونی و ایمونوالکترون میکروسکپی برای تعیین محل داخل سلولی گلیکوپروتئین هترولوگ rgp63، در مخمر بیان کننده ژن فوق مورد استفاده قرار گرفتند. فعالیت متالوپروتئیناز نوترکیب (rgp63) و همچنین تاثیر بازدارنده های آنزیمی با SDS-PAGE gelatin مطالعه گردید، توانایی مخمر در گلیکوزیلاسیون متالوپروتئیناز نوترکیب (rgp63) نیز سنجش گردید. یافته ها: PCR و (S.B) وارد شدن ژن gp63 را به گونه ای صحیح در کروموزوم مخمر نوترکیب تائید کردند. (N.B) بر روی RNA تخلیص شده از مخمر نوترکیب صحت نسخه برداری از ژن gp63، ژل 12% SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ نیز، بیان ژن فوق (تولید پروتئین نوترکیب) را در مخمر ترانسفورمنت تائید نمودند. مطالعه با SDS-PAGE gelatin gel، فعال بودن مولکول فوق را اثبات نمود. یدواستامید و EDTA با غلظت 5 میلی مولار از فعالیت این مولکول در ژل مزبور ممانعت نمودند. بررسی ها با میکروسکوپ الکترونی وجود ناحیه پروتئینی متراکم را در فضای پریپلاسمی مخمر ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی ژن نشان داد. بررسی های ایمونوالکترون میکروسکوپی و IFA نیز تایید نمودند که ناحیه پروتئینی فوق، همان پروتئین نوترکیب (rgp63) می باشد. آزمون PNGase-F نیز گلیکوزیله بودن باندهای بیش از 53 کیلودالتونی آن را اثبات نمود. نتیجه گیری: گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی تولید شده در مخمر به فرم طبیعی خود بیشتر شباهت دارد، زیرا علاوه بر گلیکوزیله بودن در SDS-PAGE gelatin gel نیز فعال می باشد

Upgrade to premium to download articles

Already have an account?login

similar resources

تولید متالوپروتئیناز ۶۳ کیلو دالتونی (gp۶۳) لیشمانیا ماژور در مخمر متیلوتروف pichia pastoris

full text

Expression of Gp63 Gene from NIH Strain of Leishmania major in Pichia pastoris

Leishmaniasis is a major infectious disease of considerable public health in more than 86 countries around the world. Several approaches toward vaccine development against this disease have been taken. Glycoprotein (gp63) is conserved among diverse species of Leishmania and has induced immunological responses in murine models. Therefore, this glycoprotein has been considered as a second generat...

full text

جداسازی و کلونینگ ژن فولیکول استیمولایتینگ هورمون انسانی hFSH با سیگنال سکانس طبیعی ژن در شاتل وکتورpPIC9 مخمر متیلوتروف Pichia pastoris

سابقه و هدف: فولیکول استیمولاتینگ هورمون (FSH) از خانواده هورمون‌های گلیکوپروتئینی هیپوفیز و متشکل از دو زیرواحد آلفا و بتا می‌باشد که فعالیت بیولوژیک این هورمون مربوط به زیرواحد بتای آن است. این مطالعه به منظورجداسازی ناحیه کدکننده ژن انسانی FSHβ با سیگنال سکانس طبیعی ژن و کلونینگ آن در شاتل وکتورpPIC9 تحت پروموتر AOX1 و سیگنال سکانس آلفا فاکتور انجام شد. مواد و روش‌ها: طی دو مرحله امپلیفیکا...

full text

طراحی و ساخت وکتور بیانی جدید در مخمر pichia pastoris دارای پروموتر القایی fmd وتوالی histag

عنوان: طراحی وساخت وکتور بیانی جدید در مخمر pichia pastoris دارای پروموتر fmd سلول های مخمری با توجه به میزان بیان بالا و سرعت رشد مناسب، میزبان های ایده آلی برای تولید پروتئین های نوترکیب در صنعت محسوب می شوند. از مخمرهای صنعتی می توان به مخمر متیلوتروف pichia pastoris اشاره کرد. اغلب برای بیان پروتئین نوترکیب در مخمر p. pastoris از پروموتر قوی و القایی aox1 استفاده می شود. یکی از مشکلات استف...

مروری بر روش های تولید پروتئین های نوترکیب درمانی در مخمر پیشیا پاستوریس

موفقیت سیستم های بیانی مخمر برای بیش از 20 سال جهت تولید پروتئین های نوترکیب امری اثبات شده است. استفاده از مخمر متیلوتروف pastoris Pichia به عنوان یک میزبان سلولی جهت بیان پروتئین های نوترکیب در صنعت دارویی طی سالهای اخیر رشد چشم گیری داشته است. سیستم بیانی مخمر pastoris Pichia با دارا بودن مزایایی چون دستکاری ژنتیکی آسان، تراکم سلولی بالا نسبت به سلول های پستانداران، دارا بودن پتانسیل بالا جه...

full text

expression of gp63 gene from nih strain of leishmania major in pichia pastoris

leishmaniasis is a major infectious disease of considerable public health in more than 86 countries around the world. several approaches toward vaccine development against this disease have been taken. glycoprotein (gp63) is conserved among diverse species of leishmania and has induced immunological responses in murine models. therefore, this glycoprotein has been considered as a second generat...

full text

My Resources

Save resource for easier access later

Save to my library Already added to my library

{@ msg_add @}

Journal title

کومش

volume 3 issue 1

pages 69- 82

publication date 2002-02

unfollow

{@ msg @}

By following a journal you will be notified via email when a new issue of this journal is published.

Keywords

No Keywords

Hosted on Doprax cloud platform doprax.com